Qualidade de peptídeos: guia completo de COA, HPLC e pureza

O que é a qualidade de um peptídeo e por que ela importa

Quando um médico ou um pesquisador avalia um peptídeo, a primeira pergunta não é farmacológica, mas química: o frasco contém a molécula declarada, na quantidade declarada e sem contaminantes relevantes? A Agência Europeia de Medicamentos (EMA), em seu guia sobre o desenvolvimento e a fabricação de peptídeos sintéticos, em vigor desde 1º de junho de 2026, resume isso sem rodeios: a pureza é um dos atributos críticos de qualidade mais importantes dessa classe de moléculas¹. As impurezas não são um detalhe técnico: uma revisão da Universidade de Gante mostra que elas podem influenciar os estudos funcionais iniciais e levar a conclusões equivocadas².

A Organização Mundial da Saúde (OMS) distingue dois problemas. Os produtos de qualidade deficiente são aqueles que não cumprem seus padrões e especificações, muitas vezes por más práticas de fabricação ou controle de qualidade insuficiente; os falsificados são aqueles que deturpam de forma deliberada sua identidade, sua composição ou sua origem³. Segundo a mesma ficha, pelo menos 1 em cada 10 medicamentos em países de renda baixa e média é de qualidade deficiente ou falsificado³. Este guia percorre os dois lados: como a qualidade é medida (certificado de análise, HPLC, massas, teor, endotoxinas), como ela é preservada (estabilidade) e o que foi encontrado quando os laboratórios analisam produtos do mercado.

De onde vêm as impurezas: síntese em fase sólida

A maioria dos peptídeos é hoje fabricada por síntese em fase sólida: a cadeia é construída sobre uma resina por meio de ciclos repetidos de desproteção, lavagem e acoplamento de aminoácidos, e ao final é clivada da resina¹². Cada etapa deixa sua possível marca. Um acoplamento incompleto produz sequências com deleção (falta um aminoácido); um aminoácido acoplado duas vezes produz sequências com inserção; a epimerização gera diastereômeros; os grupos protetores que não são totalmente removidos deixam adutos, e, ao clivar a cadeia, são liberadas espécies reativas que podem atacar triptofano, tirosina ou metionina¹². A isso se somam oxidações, dímeros e oligômeros².

Há ainda impurezas que não são peptídeos: reagentes do processo, solventes residuais, impurezas elementares e contraíons como o trifluoroacetato (TFA), que provém da própria síntese ou da purificação¹². A EMA assinala que os peptídeos sintéticos costumam usar acetato como contraíon, embora também existam sais de trifluoroacetato ou de cloreto, e pede que se defina o tipo de contraíon e se limite sua quantidade¹. No estudo de Gante, a maioria das impurezas relacionadas encontradas eram justamente sequências nas quais faltavam aminoácidos⁴.

Pureza por HPLC: o que mede e o que não mede

O número que aparece em quase todos os certificados («pureza ≥98 %») vem de uma cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em fase reversa com detector ultravioleta. Trata-se de uma normalização de áreas: a área do pico principal frente à soma de todos os picos detectados. Isso significa que pelo menos 98 % do sinal ultravioleta integrado corresponde ao pico principal; não significa que 98 % do pó seja peptídeo. A leitura detalhada desse número, com seus comprimentos de onda e limites de notificação, está em como ler o certificado de análise de um peptídeo.

O método tem limites que convém conhecer. Uma impureza que elui junto com o pico principal fica escondida dentro dele; a EMA pede que se leve em conta esse risco de coeluição e, se duas impurezas aparecerem como um único pico, que se aplique o limite de qualificação de 1,0 %¹. Para os peptídeos sintéticos, a Farmacopeia Europeia estabelece que as impurezas relacionadas são notificadas acima de 0,1 %, identificadas acima de 0,5 % e qualificadas acima de 1,0 %¹. Um bom certificado declara o método e anexa o cromatograma com os picos integrados; a EMA pede cópias dos cromatogramas relevantes¹.

Identidade: espectrometria de massas e métodos ortogonais

A pureza diz quanto do material é um único componente; não diz qual. Essa é a função da espectrometria de massas. A ionização por electrospray, descrita para biomoléculas grandes por Fenn e colaboradores em 1989, produz íons com várias cargas a partir dos quais se reconstrói a massa da molécula⁵. A EMA pede espectros representativos e tabelas com as massas teóricas e observadas¹.

A massa tem pontos cegos: dois diastereômeros pesam exatamente o mesmo. Por isso a EMA recomenda, para identificar um peptídeo na especificação e na liberação de um lote, pelo menos dois métodos ortogonais: massa, tempo de retenção relativo, LC-MS, mapeamento peptídico, bioatividade, análise de aminoácidos ou ressonância magnética nuclear¹. O exemplo prático mais citado é o do grupo de Gante: entre os peptídeos encomendados com pureza ≥95 %, o composto principal de uma amostra tinha uma estrutura diferente da solicitada⁴, um erro que um número de pureza não teria revelado.

Pureza não é teor: contraíons, água e peptídeo líquido

Este é o ponto que mais gera confusão. Um pó liofilizado com 99 % de pureza por HPLC contém, além disso, contraíons, água e, às vezes, solventes. O caso mais bem documentado é o de um candidato a material de referência certificado de angiotensina II: o contraíon TFA representava quase 25 % da massa e o valor de pureza atribuído foi de 691 ± 9 mg/g⁶. Ou seja, cerca de 69 % do pó era peptídeo. A EMA, por sua vez, estabelece que os limites de uma dosagem por cromatografia são expressos sobre a substância anidra e livre de contraíon¹.

O contraíon não apenas pesa: também pode atuar. Em culturas de osteoblastos, o TFA a 10⁻⁸–10⁻⁷ M reduziu o número de células, e os sais de TFA de amilina e calcitonina impediram a detecção de um efeito proliferativo ou sugeriram um efeito antiproliferativo inexistente; os autores recomendaram converter os peptídeos em cloridrato antes de avaliar seu efeito biológico⁷. A questão dos sais tem consequências próprias nos GLP-1, revisadas em GLP-1 manipulados: sais, impurezas e anticorpos.

A água é o terceiro componente. A EMA adverte que os peptídeos costumam ser pós muito higroscópicos, pede que a higroscopicidade seja indicada e espera que o teor de água faça parte dos protocolos de estabilidade¹. A consequência prática é saber se os miligramas de um rótulo se referem ao pó ou ao peptídeo líquido.

Como ler um certificado de análise (COA)

O certificado de análise resume os testes feitos em um lote específico. A lista da EMA para a especificação de um peptídeo sintético serve como modelo para ler qualquer um¹. Cada teste responde a uma pergunta diferente:

• Aspecto e identificação (massa mais um segundo método): é a molécula declarada?¹⁵
• Pureza (impurezas totais e individuais): quanto do sinal corresponde ao pico principal?¹
• Impurezas de alto peso molecular (agregados, dímeros, oligômeros): o peptídeo se agregou?¹
• Dosagem ou teor (por exemplo, por LC, análise de aminoácidos ou qNMR): quanto peptídeo há no pó?¹⁶
• Contraíon e TFA residual: que sal é e quanto pesa?¹⁷
• Água e solventes residuais: o que mais há no pó?¹
• Endotoxinas bacterianas e pureza microbiológica: é adequado do ponto de vista microbiológico?¹⁸

As endotoxinas merecem uma nota à parte. Elas são medidas com o ensaio do lisado de amebócitos de Limulus (LAL), que há mais de 30 anos é aceito no lugar do teste de pirogênio em coelhos e que é descrito no capítulo <85> da Farmacopeia dos EUA⁸. Estéril e livre de endotoxinas não são a mesma coisa: os frascos de semaglutida analisados em um estudo de vigilância de mercado não tinham microrganismos viáveis, mas todos continham endotoxinas, entre 2,16 e 8,95 EU/mg¹⁸. Um resultado bem informado traz valor, unidades e limite.

Por fim, um certificado só vale para o lote que descreve: número do lote, datas da análise, método, dados brutos e assinatura. A EMA espera rastreabilidade do material desde a síntese até o princípio ativo final¹. Para quem está começando, ler o rótulo e o certificado de análise, sem medo explica a mesma coisa passo a passo.

Estabilidade: do pó liofilizado ao frasco reconstituído

Um peptídeo de alta pureza pode se degradar depois. A EMA enumera as rotas habituais de degradação dos peptídeos sintéticos: oxidação, hidrólise, isomerização, desamidação, formação de imida cíclica (aspartimida), dicetopiperazina e ácido piroglutâmico, β-eliminação, troca de dissulfetos e acetilação, entre outras¹. Várias estão bem quantificadas. A desamidação de asparagina e glutamina depende muito dos aminoácidos vizinhos: um modelo com 648 combinações de sequência incluiu meias-vidas muito longas, de 2–50 anos em algumas sequências⁹. Os resíduos de ácido aspártico são hidrolisados em meio muito ácido e se isomerizam acima de pH 6¹⁰. A fotooxidação afeta sobretudo triptofano, tirosina, fenilalanina e cisteína/cistina¹².

O pó liofilizado não é inerte. Em um hexapeptídeo modelo liofilizado, a umidade residual, a temperatura e, sobretudo, o tipo de excipiente de carga influenciaram de forma significativa a degradação em estado sólido¹¹. A EMA indica que, para prevenir ou reduzir a degradação, os peptídeos são armazenados em geral refrigerados (5 °C ± 3 °C) ou congelados (−20 °C ± 5 °C)¹. As vias físicas são igualmente importantes: a agregação depende da sequência, da concentração, do pH, da carga, das superfícies e interfaces, da temperatura, da agitação e da liofilização¹³, e a adsorção a tubos de vidro ou plástico pode fazer com que a concentração real não coincida com a nominal¹⁴.

A reconstituição inicia o relógio. A água bacteriostática é água estéril com 0,9 % ou 1,1 % de álcool benzílico em uma embalagem multidose; seu rótulo adverte que não deve ser usada em neonatos e que as soluções preparadas não devem ser armazenadas, salvo se o fabricante do fármaco indicar o contrário¹⁵. Os peptídeos aprovados fixam períodos de uso concretos que decorrem de seus próprios estudos: a tesamorelina reconstituída é girada sem agitar, é conservada a 20–25 °C e é descartada após 7 dias, e seu frasco de água bacteriostática após 28 dias¹⁶; a caneta de semaglutida pode ser conservada por 56 dias após o primeiro uso e não deve ser congelada nem usada se tiver sido congelada¹⁷. Esses prazos não são extrapoláveis para outros peptídeos. O detalhe de cada rota está em estabilidade dos peptídeos: do pó liofilizado ao frasco reconstituído, e um exemplo aplicado a um peptídeo específico, em GHK-Cu: guia completo do peptídeo de cobre.

Falsificações e qualidade deficiente: o que os laboratórios encontraram

Os estudos de mercado mostram a distância que pode haver entre o declarado e o medido. Em um estudo de vigilância de semaglutida vendida por farmácias ilegais on-line, os três frascos liofilizados recebidos foram considerados provavelmente de qualidade deficiente ou falsificados: a quantidade de semaglutida superava o rotulado em 28,6–38,7 %, a pureza medida foi de 7,7–14,4 % frente aos 99 % declarados e todos continham endotoxinas¹⁸. Em uma análise sistemática dos dez peptídeos falsificados mais frequentes em um mercado europeu, comprados de farmácias ilegais on-line, a pureza dos peptídeos com cisteína foi de 5–75 %, várias amostras tinham arsênio até dez vezes acima do limite de toxicidade para injetáveis e uma tinha chumbo¹⁹. Outro relatório encontrou Bacillus cereus hemolítico em dois peptídeos injetáveis ilegais²⁰.

As consequências clínicas podem ser graves. Uma série de casos descreveu duas pessoas sem diabetes nem obesidade que injetaram semaglutida obtida sem receita e chegaram em coma com hipoglicemia grave, hipopotassemia e hipotermia: a causa era insulina sintética²¹. A OMS emitiu em 2024 um alerta por lotes falsificados de Ozempic detectados em três países, com risco de dose incorreta, contaminação ou ingredientes substituídos, e recomendou conferir o número do lote e o número de série²². Mesmo fora da falsificação há problemas: em produtos manipulados de tirzepatida combinada com análogos de vitamina B12 foi identificada uma impureza nova e disseminada, formada pela reação entre as duas moléculas, cujos efeitos clínicos são desconhecidos²³. Os achados de laboratório são revisados em O que realmente há no frasco? e o contexto clínico desses fármacos, em GLP-1: guia completo de semaglutida, tirzepatida e mais.

Perguntas em aberto

Restam várias questões sem resolução. A primeira é a imunogenicidade: as impurezas relacionadas podem introduzir epítopos de células T, e por isso foram propostos arcabouços de avaliação do risco imunogênico para peptídeos e suas impurezas²⁴. A segunda é a falta de dados: para muitos peptídeos fora dos fármacos aprovados há poucos dados publicados de estabilidade na forma reconstituída, e os princípios disponíveis provêm de proteínas, peptídeos modelo e produtos aprovados⁹¹¹¹³. A terceira é metodológica: os estudos de mercado analisam poucas amostras (três frascos no caso da semaglutida) e não permitem estimar a qualidade média de um mercado¹⁸. O razoável é tratar a qualidade como um dado que se verifica por lote, com métodos ortogonais e com uma análise independente nos lotes-chave¹⁴.