Certificado de análise de peptídeos: como lê-lo

Guia completo: Qualidade de peptídeos: guia completo de COA, HPLC e pureza

Para que serve um certificado de análise

O certificado de análise (COA, na sigla em inglês) resume os testes feitos em um lote específico. Para um laboratório ou um grupo de pesquisadores, é o primeiro filtro de qualidade: as impurezas relacionadas ao peptídeo podem influenciar os estudos funcionais e levar a conclusões equivocadas². O guia da EMA, em vigor desde 1º de junho de 2026, enumera a especificação esperada, da identificação e da pureza ao contraíon, o TFA residual, a água, os solventes residuais, as endotoxinas bacterianas e a pureza microbiológica⁵. Essa lista é um bom modelo para ler qualquer certificado.

Pureza por HPLC: o que significa «≥98 %»

O número mais visível costuma vir de uma cromatografia líquida de fase reversa com detector ultravioleta, o método de rotina para o controle de qualidade de peptídeos³. O cálculo é uma normalização de áreas: a área do pico principal em relação à área de todos os picos detectados. Em um estudo de controle de qualidade da Universidade de Gante, a detecção foi feita a 210 e 215 nm, com um limite de notificação de 0,1 % da área do pico principal¹; para a oxitocina e os acetatos, foi descrita a detecção a 220 nm⁸. Portanto, «≥98 %» significa que pelo menos 98 % do sinal ultravioleta integrado corresponde ao pico principal.

Essa definição tem limites que convém conhecer. A água e os contraíons são medidos em testes separados e não fazem parte dessa porcentagem⁵⁷. Uma impureza que elui junto com o pico principal fica escondida dentro dele: a EMA pede que se considere o risco de impurezas coeluentes e, se forem observadas como um único pico, que se aplique o limite de qualificação de 1,0 %⁵. Um bom certificado declara o método e anexa o cromatograma com os picos integrados; as normas da FDA exigem que o registro de laboratório conserve esses dados¹⁵.

O que há na porcentagem restante? Sobretudo impurezas próprias da síntese em fase sólida: sequências com um aminoácido a menos (deleções) ou a mais (inserções), diastereômeros por racemização, restos de grupos protetores, oxidações e dímeros². Os órgãos reguladores fixam limites precisos. Segundo a Farmacopeia Europeia, as impurezas relacionadas ao peptídeo são notificadas acima de 0,1 %, identificadas acima de 0,5 % e qualificadas acima de 1,0 %⁵. A FDA, em seu guia para genéricos sintéticos de glucagon, liraglutida, nesiritida, teriparatida e teduglutida (resumido em uma apresentação oficial de 2022), pede que se identifique e justifique toda impureza nova entre 0,10 % e 0,5 %, e estabelece que uma impureza nova «> 0.5% is not acceptable» (em português: «> 0,5 % não é aceitável»)⁶.

Identidade: a espectrometria de massas

A pureza indica quanto do material é um único componente; não diz qual é. Para isso existe a espectrometria de massas. A ionização por electrospray (ESI) produz íons com várias cargas: o espectro de uma molécula grande aparece como uma série de picos em que cada um difere do vizinho em uma carga⁴. Por isso, um peptídeo de massa M aparece em relações massa/carga como (M + 2H)/2 ou (M + 3H)/3, e o programa do equipamento reconstrói a massa a partir dessa série. A EMA pede tabelas com os valores de massa teóricos e observados⁵. Ao ler o certificado, convém verificar se a massa observada coincide com a teórica da sequência declarada, se fica esclarecido tratar-se de massa monoisotópica ou média e se o espectro está anexado.

A massa tem um ponto cego: dois diastereômeros pesam exatamente o mesmo, e a racemização é uma impureza conhecida da síntese². A EMA recomenda pelo menos dois métodos ortogonais de identificação (por exemplo, massa junto com tempo de retenção relativo, mapeamento peptídico, análise de aminoácidos ou RMN) e adverte que o controle de diastereômeros pode exigir métodos específicos⁵. No estudo de Gante, o composto principal de uma amostra tinha uma estrutura diferente da solicitada¹, um erro que a pureza por si só não teria revelado.

Pureza não é conteúdo: contraíons, sais e água

Este é o ponto que mais gera confusão. Um pó liofilizado com 99 % de pureza por HPLC não é 99 % peptídeo em peso: contém também contraíons, água e, às vezes, solventes. O caso mais bem documentado é um candidato a material de referência certificado de angiotensina II do Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá: o contraíon trifluoroacetato representava quase 25 % da massa e o conteúdo final atribuído foi de 691 ± 9 mg/g⁷. Ou seja, cerca de 69 % do pó era peptídeo. Esse valor é o conteúdo líquido de peptídeo; a EMA indica que a dosagem por cromatografia é expressa sobre a substância anidra e livre de contraíon⁵.

Por que existem contraíons? Os peptídeos são cortados da resina e purificados com ácido trifluoroacético, de modo que os peptídeos catiônicos são obtidos como sais de trifluoroacetato; a maioria dos peptídeos aprovados é comercializada, em contrapartida, como acetatos⁸. A diferença não é apenas de peso. Em culturas de osteoblastos, o TFA a 10⁻⁸–10⁻⁷ M reduziu o número de células, e os sais de TFA de amilina e calcitonina chegaram a ocultar um efeito proliferativo ou a sugerir um efeito antiproliferativo inexistente; os autores recomendaram converter os peptídeos em cloridrato antes de avaliar seus efeitos biológicos⁹. O contraíon pode ser quantificado por cromatografia iônica, e a liofilização com ácido clorídrico ou acético reduz o TFA¹⁰. A questão dos sais também importa nos GLP-1, como se explica em GLP-1 manipulados: sais, impurezas e anticorpos.

A água é o terceiro componente. A umidade residual é um atributo crítico de qualidade dos produtos liofilizados, e a titulação de Karl Fischer é o método habitual para medi-la, em comparação com alternativas não destrutivas como a espectroscopia no infravermelho próximo¹¹; a EMA a inclui na especificação e espera que faça parte dos estudos de estabilidade quando o pó é higroscópico⁵. A consequência prática para o pesquisador é saber se os miligramas do rótulo são de pó ou de peptídeo líquido: por exemplo, 10 mg de pó com um conteúdo de peptídeo de 70 % fornecem 7 mg de peptídeo. Como conservar depois esse pó é explicado em Estabilidade dos peptídeos.

Endotoxinas, esterilidade e solventes residuais

O teste de endotoxinas e o de esterilidade medem coisas diferentes. As endotoxinas são determinadas com o ensaio do lisado de amebócitos de Limulus (LAL), que a FDA aceita há mais de 30 anos no lugar do teste de pirogênios em coelhos e que é descrito no capítulo <85> da USP¹². O resultado deve ser expresso com número e unidades, por exemplo em EU/mg, junto ao seu limite. Um estudo húngaro sobre semaglutida vendida on-line mostra por que ambos os testes importam: os três frascos liofilizados comprados não tinham microrganismos viáveis no momento da análise, mas todos continham endotoxinas, entre 2,16 e 8,95 EU/mg¹³.

Os solventes residuais são regidos pelo guia ICH Q3C, que os divide em três classes: solventes que devem ser evitados (classe 1), que devem ser limitados (classe 2) e de baixo potencial tóxico (classe 3)¹⁴. Para a classe 2, fixa limites concretos: 410 ppm para o acetonitrilo, 600 ppm para o diclorometano e 880 ppm para a N,N-dimetilformamida; para a classe 3, até 0,5 % é considerado aceitável sem justificativa adicional¹⁴.

Lote, datas e laboratório

Um certificado só vale para o lote que descreve. As normas de boas práticas da FDA exigem que o registro de laboratório identifique a amostra com seu número de lote, a data de coleta e de recebimento, o método usado, todos os dados obtidos (incluindo os gráficos e espectros dos instrumentos, identificados com o lote), os cálculos, as iniciais ou a assinatura de quem fez cada teste com sua data e a revisão assinada de uma segunda pessoa¹⁵. A EMA espera rastreabilidade do material desde a síntese até o princípio ativo final⁵.

Análise própria ou de terceiros? O grupo de Gante constatou que, embora os 98 peptídeos viessem com um certificado de pureza ≥95 %, apenas 43 a cumpriam, e recomendou aos pesquisadores manter um controle de qualidade próprio¹. Para um laboratório, a opção mais sólida é combinar o certificado do fornecedor com uma verificação independente, ao menos de identidade por massa, nos lotes-chave de cada protocolo de pesquisa.

O que deve mostrar o COA de uma mistura como BPC-157 e TB-500?

Deve mostrar uma identificação separada de cada componente, e não um único resultado para a mistura. Um único valor de pureza por HPLC descreve o conjunto de sinais e não diz quanto há de cada peptídeo; por isso, o certificado de uma mistura deveria indicar a massa observada de cada componente em relação à sua massa teórica, o cromatograma com cada pico atribuído e o conteúdo declarado de cada um⁵. O segundo ponto é a identidade real do componente: o produto vendido como TB-500 foi caracterizado como o fragmento 17-23 da timosina beta 4 com acetilação N-terminal, e não como a proteína completa¹⁶¹⁷, uma diferença que o certificado deve refletir na sequência declarada (veja TB-500 não é timosina beta-4).

Para o BPC-157, existem métodos de espectrometria de massas descritos na literatura, tanto para detectar o peptídeo em material apreendido quanto para caracterizar seus metabólitos com equipamentos de alta resolução¹⁸¹⁹. Um certificado que declare ambos os componentes, mas anexe apenas um espectro, ou nenhum, não permite verificar essa identificação. O contexto de segurança e evidência de ambos é resumido em BPC-157 e TB-500: evidência e segurança.

Identificação de peptídeos: como se confirma o que há no frasco

A identificação é confirmada combinando métodos que medem coisas diferentes: a massa observada em relação à teórica, o tempo de retenção relativo e, quando há risco de isômeros, um método que distinga diastereômeros⁵. É o que a EMA chama de métodos ortogonais. Nenhum dos três substitui o certificado: servem para verificar que o lote do frasco é o lote do documento. Um guia mais geral sobre pureza, estabilidade e verificação está em Guia de qualidade de peptídeos: COA, HPLC, pureza e estabilidade.

Sinais de alerta e limites do certificado

• Sem espectro de massas nem massa observada: a pureza sozinha não confirma a identidade¹⁵.
• Cromatogramas idênticos (mesmos tempos de retenção, mesmas áreas, mesma linha de base) em lotes distintos: cada lote gera seus próprios dados¹⁵.
• Sem número de lote, sem datas de análise ou sem assinaturas¹⁵.
• Pureza sem conteúdo de peptídeo, contraíon nem água quando o material é pesado para preparar soluções⁵⁷.
• Endotoxinas como «conforme» sem número nem unidades¹²¹³.
• Um 99,9 % sem cromatograma integrado nem método, ou um laboratório que não pode ser identificado¹¹⁵.

Mesmo um certificado impecável tem limites. É uma fotografia do lote na data da análise; por isso a EMA exige estudos de estabilidade à parte⁵. Os estudos de mercado mostram, além disso, a distância que pode haver entre o declarado e o medido: em três frascos de semaglutida rotulada a 99 %, a pureza medida foi de 7,7–14,4 %¹³, um achado revisado em O que há realmente no frasco?. Um certificado bem lido não elimina esses riscos; permite detectá-los a tempo.

Perguntas frequentes

• O que significa pureza ≥98 % em um COA? Que pelo menos 98 % da área do sinal ultravioleta integrado pertence ao pico principal; não é a porcentagem de peptídeo em peso¹⁵⁷.
• Como se identifica um peptídeo em um certificado? Com a massa observada em relação à teórica e pelo menos um segundo método ortogonal⁵.
• Pureza e conteúdo são a mesma coisa? Não: o conteúdo líquido desconta contraíons, água e solventes; em uma referência de angiotensina II foi de 69 %⁷.
• Estéril significa livre de endotoxinas? Não; são testes distintos e são informados com número e unidades¹²¹³.
• O certificado do fornecedor serve por si só? O grupo de Gante recomenda manter um controle próprio, porque apenas 43 de 98 peptídeos cumpriram sua pureza declarada¹.